Экологическая лихенология

Изучение структуры лишайниковых веществ было начато в 1930-х годах японским исследователем Я. Асахиной в связи с развитием им метода микрокристаллизации. Эта техника была проста, не требовала никакого специального оборудования и позволяла точно определять лишайниковые кислоты. Она включала экстракцию метаболитов ацетоном из фрагмента слоевища лишайника, выпаривание растворителя и перекристаллизацию остатка на предметном стекле микроскопа. После этого изучались цвет и структура кристаллов и сравнивались с эталонными образцами. Однако, несмотря на многие преимущества, этот метод не мог быть применен для изучения следовых количеств веществ и для изучения смесей.

В настоящее время для обнаружения, выделения, очистки и определения состава вторичных метаболитов лишайников используются более точные методы: тонкослойная хроматография (TLC), высокоэффективная тонкослойная хроматография (HPTLC), радиальная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), газовая хроматография (GC), масс-спектрометрия (MS), спектроскопия ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³C или ¹H (¹³C, ¹H NMR) и рентгеноструктурный анализ. Однако наиболее распространенным в виду простоты и дешевизны является метод тонкослойной хроматографии.

К настоящему времени вторичные метаболиты изучены для более 5000 видов лишайников, что составляет 33 % от всего биоразнообразия. Не все лишайниковые вещества являются специфичными: из около 700 известных вторичных метаболитов около 60 отмечены у свободноживущих грибов и даже высших растений. Например, антрахинон париетин, оранжевый пигмент, характерный для представителей порядка Teloschistales, отмечен для грибов родов Achaetomium, Alternaria, Aspergillus, Dermocybe, Penicillium, а также для высших сосудистых растений родов Rheum, Rumex и Ventilago. С другой стороны, у лишайников обнаружены вещества, типичные для высших растений, например, брассикастерол.

О путях биосинтеза лишайниковых веществ известно немного. Как правило, представления об их синтезе основаны на исследованиях аналогичных веществ, характерных для свободноживущих грибов. Считается, что большинство вторичных метаболитов образуется в процессе ацетат-полималонатного пути, некоторые – шикиматного и мевалонатного путей. С помощью лабораторных исследований на культурах лишайников было установлено, что пара-депсиды играют ключевую роль как предшественники мета-депсидов, депсонов, дифениловых эфиров, депсидонов и дибензофуранов.

Среди продуктов ацетат-полималонатного пути широко представлены ароматические соединения. Большинство формируются соединением двух или трех фенольных колец орцинольного или β-орцинольного типа через эфирные, сложноэфирные и простые углеродные связи. Считается, что продукты ацетат-полималонатного пути свойственны только лишайникам, в частности, такие вещества как депсиды, депсидоны, дибензофураны, усниновая кислота и депсоны. Производные ацетат-полималонатного пути (хромоны, ксантоны и антрахиноны) идентичны или аналогичны продуктам нелихенизированых грибов и высших растений.

Вторичные метаболиты неравномерно распределены в слоевище лишайника. Некоторые лишайниковые вещества, например, красные и оранжевые антрахиноны и их производные, а также усниновая кислота, содержатся в верхнем коровом слое. Бесцветные депсиды и депсидоны откладываются в сердцевине лишайникового слоевища. Изучение локализации метаболитов иногда является трудной задачей. В настоящее время для ее решения применяются методы сканирующей электронной микроскопии (SEM) и лазерной микрозондовой масс-спектрометрии (LMMS). Например, с помощью SEM удалось установить, что кристаллы на поверхности корового слоя Lecanora cerebellina имеют двойственную структуру. Люминесцирующие хлорсодержащие кристаллы с помощью метода энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX) были определены как ксантон винеторин. Анализ не люминесцирующих кристаллов показал высокое содержание в них кальция. Экспериментально было установлено, что эти образования являются оксалатами кальция. Рентгеновская дифрактометрия (XRD) кристаллов с поверхности Pyxine caesiopruinosa показала, что это дигидраты оксалата кальция, а не вторичный метаболит лихексантон, известный для этого вида лишайника. Разные лишайниковые вещества могут содержаться в различных участках слоевища. Методами LMMS и трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) было установлено, что лихексантон и руссулон (тетрациклический антрахинон) локализованы в разных участках плодового тела Lecidea russula Ach.

Вторичные метаболиты, локализованные в верхнем коровом слое лишайников, особенно произрастающих в местах с высокой инсоляцией, выполняют светопоглощающую функцию. Считается, что именно регулирование интенсивности светового потока, достигающего водорослевой зоны, является первичной функцией многих лишайниковых веществ. Дополнительной функцией вторичных метаболитов коры является защита таллома от чрезмерного ультрафиолетового излучения. Интересными являются результаты исследования вторичных метаболитов Lecanora somervellii. Образцы этого вида, произрастающие в высокогорьях Гималаев, содержали в коровом слое 2 светозащитных вещества – калицин (производное пульвиновой кислоты) и усниновую кислоту (поликетид). В более низких высотах этот вид содержал только один метаболит – усниновую кислоту. К типичным веществам, содержащимся в коровом слое лишайников, относятся β-орцинол пара-депсиды атранорин и хлоратранорин, усниновая кислота, антрахиноны, ксантоны и производные пульвиновой кислоты.

Вторичные метаболиты корового слоя ранее недооценивались лихенологами с точки зрения их применимости в филогенетических исследованиях. Было известно небольшое число лишайниковых веществ, общих для видов, входящих в высшие таксоны, например, вульпиновая кислота, характерная для видов рода Letharia, или антрахиноны, включая париетин, содержащиеся в коре представителей семейства Teloschistaceae. Однако учитывая высокую физиологическую важность этих веществ, кажется вероятным, что их формирование имело большое эволюционное значение. В настоящее время вторичные метаболиты коры начинают использоваться в систематике лишайников, в частности, при разграничении родов крупного семейства Parmeliaceae.

В отличие от корового слоя, вторичные метаболиты сердцевины широко используются при идентификации видов лишайников. Возможность использования вторичных метаболитов для определения лишайников подтверждается постоянным химическим составом представителей большинства видов вне зависимости от их географического распространения и субстратной приуроченности. В пределах комплекса морфологически схожих видов выделяют, как правило, три типа химических вариаций: отличия основных веществ, отличия хемосиндромов и отличия сопутствующих метаболитов.

Если популяции морфологически идентичны, но имеют строгие отличия химического состава вследствие замены одних метаболитов на другие, их считают отличающимися по содержанию основного вещества. Классическим примером является вид Pseudevernia furfuracea, имеющий три химические расы. Популяции первого типа содержат оливеторовую кислоту и распространены в Северной Европе. Популяции второго типа содержат физодовую кислоту и произрастают в Южной Европе и северной части Африки. Популяции третьей химической расы содержат леканоровую кислоту и произрастают в Северной Америке. Популяции первых двух рас биогенетически связаны, поскольку оливеторовая и физодовая кислоты могут быть получены одна из другой посредством простого химического превращения. Третья раса считается отдаленной, потому что леканоровая кислота биосинтетически не связана с предыдущими двумя веществами. На основании химической и географической разобщенности Североамериканские представители были выделены в самостоятельный вид Pseudevernia consocians. Представителей первых двух химических рас считают одним биологическим видом с двумя химическими вариациями.

Описание новых видов на основании различного набора вторичных метаболитов (подобно Pseudevernia consocians) должно обязательно подтверждаться различным географическим распространением таких популяций и, что является более точным маркером, генетической разобщенностью. Экологические отличия нельзя использовать как критерии при описании видов, поскольку различные химические расы, произрастающие рядом, часто показывают генетическую целостность. Также необходимо учитывать, что определенные популяции могут являться как потенциально самостоятельными видами, так и гибридами двух соседствующих различных химических рас. Однако в нескольких случаях было отмечено, что представители разных химических рас произрастали в строго определенных экологических условиях.

Хемосиндромами называют группы биосинтетически связанных метаболитов. Лишайники могут содержать определенное химическое вещество в качестве основного метаболита, а также небольшие количества других, близких по происхождению лишайниковых веществ в качестве дополнительных. В связи с этим, вещества, являющиеся основными у одних видов или популяций, могут быть дополнительными у других, и наоборот. Существование хемосиндромов сильно затрудняет определение промежуточных звеньев между разными химическими расами, поскольку необходимо учитывать не только сами метаболиты, но и их количественные показатели.

Данные о содержании сопутствующих химических веществ следует осторожно использовать в таксономических исследованиях, поскольку они встречаются спорадически у разных видов лишайников и часто не связаны с морфологическими отличиями или особенностями распространения.

Намного реже лишайниковые вещества сердцевины используют при определении таксонов более высокого ранга, чем вид. Примером могут служить химические отличия представителей родов Cetrelia, содержащих производные орцинола, и Platismatia, содержащих жирные кислоты или производные β-орцинола.

Начало использования вторичных метаболитов сердцевины в таксономии лишайников считается очень важным шагом, поскольку обнаружение химических различий часто приводило к переоценке важности пропускаемых ранее морфологических отличий. Ярким примером тому может служить разграничение видов Punctelia subrudecta с леканоровой кислотой и светлой коричневатой нижней поверхностью и Punctelia borreri с гирофоровой кислотой и черной нижней поверхностью таллома. Также следует отметить, что данные о содержащихся лишайниковых веществах используются в кладистическом анализе при проведении филогенетических исследований.

Кроме специфичных вторичных метаболитов у лишайников имеются также особые полисахариды клеточных стенок, из которых наиболее часто встречаются лихенан, изолихенан и галактоманнан. В отличие от лишайниковых веществ, эти полисахариды используются в основном для определения высших таксонов грибов и лишайников. Примером может служить описание четырех групп полисахаров, характерных для разных видов семейства Parmeliaceae: изолихенан, лихенан Xanthoparmelia-типа, лихенан Cetraria-типа и лихенан промежуточного типа. На основании различий полисахаридного состава были, например, дифференцированы роды пармелиоидных лишайников светло-зеленого цвета. Было показано, что Psiloparmelia и Flavoparmelia содержат изолихенан, Arctoparmelia – лихенан Cetraria-типа, а Xanthoparmelia – лихенан Xanthoparmelia-типа.